Marcatura Isotopica

In questa pagina sono riportate diverse strategie di marcatura isotopica usate per studi di proteine mediante spettroscopia NMR.

Ad eccezione della marcatura isotopica in sistemi “cell-free”, la marcatura delle proteine è preferenzialmente effettuata mediante espressione delle proteine in batteri. La marcatura isotopica è ottenuta mediante l’uso, nei terreni di coltura, di particolari nutrienti. Nella gran parte dei casi è usato un terreno minimo contenente tutti i sali e gli elementi necessari alla crescita, ad esclusione di fonti di carbonio e azoto non marcate (ad es. amminoacidi, proteine e zuccheri), che invece verranno introdotte nel terreno mediante composti di azoto e carbonio marcati con isotopi stabili.

Marcatura ¹⁵N

Preparazione di Proteine

La produzione di proteine marcate con 15N è semplice e poco costosa. La proteina può essere ottenuta mediante espressione in batteri cresciuti in terreno minimo con supplemento di ¹⁵NH₄Cl e glucosio.

Applicazioni

Usando la proteina marcata con 15N, è possibile effettuare esperimenti standard di 2D NMR-HSQC.

Gli spettri HSQC della proteina consentono di valutare se la proteina ha una struttura tridimensionale stabile e, in base alla qualità dello spettro, è possibile valutare se sia conveniente procedere con più complesse strategie di marcatura isotopica.

Inoltre è anche possibile effettuare esperimenti di NMR, quali ad esempio “N-H residual dipolar couplings” (RDCs) ed altri, che consentono di dare informazioni di dinamica della proteina.

Se la proteina è di piccole dimensioni (<~ 150 amminoacidi) è possibile assegnare le risonanze dell’¹⁵N del backbone effettuando esperimenti ¹⁵N-NOESY e ¹⁵N-TOCSY. La ¹⁵N –proteina, infine, potrà essere utilizzata per effettuare esperimenti di titolazione con ligandi, noti o potenziali, e valutare il grado di stabilità dei complessi.

Reference: L.P. McIntosh and F.W. Dahlquist (1990) Quart. Rev. Biophys. 23 1-38. (Link to Article)

Marcatura ¹⁵N, ¹³C

Preparazione della proteina

La marcatura ¹⁵N,¹³C è comunemente nota come “doppia marcatura” della proteina. La proteina è prodotta mediante espressione in batteri fatti crescere in terreno minimo con supplemento di¹⁵NH₄Cl e ¹³C-glucosio.

Applicazioni

Questo tipo di marcatura è molto comune e permette di assegnare gli atomi ¹H, ¹³C e ¹⁵N sia del backbone che delle catene laterali degli amminoacidi utilizzando esperimenti di NMR-3D.

Le assegnazioni delle risonanze consentiranno di calcolare la struttura della proteina in soluzione in modo accurato.

Referenza: L.P. McIntosh and F.W. Dahlquist (1990) Quart. Rev. Biophys. 23 1-38. (Link to Article)

Marcatura ¹⁵N, ¹³C, ²H

Preparazione della proteina

La marcatura ¹⁵N,¹³C, 2H è comunemente nota come “tripla marcatura” della proteina. La proteina è prodotta mediante espressione in batteri fatti crescere in terreno minimo con supplemento di¹⁵NH₄Cl e ¹³C-glucosio e usando D₂O al posto di H₂O. Da questo tipo di espressione si potranno ottenere catene laterali degli amminoacidi della proteina con il 70-80% di deuterio, vi sarà una certa quantità di 1H dovuti al glucosio. Più alti livelli di deuterazione della proteina (circa 95%), potranno essere ottenuti usando ¹³C,²H-glucosio. Tuttavia, un tale tipo di marcatura risulta essere più costosa ed in molti casi, può essere sufficiente la marcatura meno costosa. E’ da considerare che gli H legati all’N dei gruppi NH sono scambiabili con il solvente. Ciò comporta che vi potrà essere uno scambio con ¹H durante le fasi di purificazione della proteina che avvengono in soluzione acquosa. Pertanto, molti dei normali esperimenti basati sugli NH potranno essere anche effettuati sulla proteina triplamente-marcata.

Applicazioni

La deuterazione è principalmente usata per proteine di grandi dimensioni. Tenendo in considerazione il loro più basso “tumbling” molecolare e le proprietà di rilassamento, esse sono più complesse da studiare via NMR e la qualità degli spettri è peggiore; i picchi possono diventare talmente larghi che non è ottenibile alcuno spettro.

Grazie alla deuterazione della proteina, con la rimozione di molti ¹H (protoni), vi sarà un notevole miglioramento delle proprietà di rilassamento. L’assegnazione del backbone e dei Cb delle proteine triplamente marcate è possibile usando versioni “out-and-back” degli esperimenti di HNCACB e HN(CO)CACB. E’ da notare che i “chemical shift” del carboni C_a e C_b saranno spostati più di metà di un ppm o più dai loro valori nella proteina marcata con ¹⁵N,¹³C, ciò a causa dell’effetto dell’isotopo deuterio.

Referenza:
D.M. LeMaster (1990) Quart. Rev. Biophys. 23 133-174. (Link to Article)

Marcatura IVL – Ile, Val e Leu

Amminoacidi con gruppi metilici nelle catene laterali

Preparazione della proteina

Lo schema di produzione di proteine marcate IVL è quello che produce proteine uniformemente marcate ²H,¹³C,¹⁵N, eccetto per le catene laterali degli amminoacidi Ile, Val e Leu che saranno marcate mediante il seguente schema:

Isoleucina, valina e leucina contengono un gruppo metilico che è marcato ²H¹²C e uno che è marcato ¹H¹³C. Nell’Isoleucina è sempre il gruppo metilico δ1 che è protonato e con ¹³C, mentre il gruppo metilico γ2 è deuterato e con ¹²C. Per la leucina e la valina i gruppi metilici non sono marcati stereo-selettivamente

Questo comporta che metà delle valine /leucine della proteina saranno marcate ¹³C e¹H ai metili γ1/δ1 e l’altra metà al gruppo γ2/δ2.

Per tale motivo, negli spettri NMR, i picchi corrispondenti ai gruppi metilici sia delle valine che delle leucine aumentano, ma solo di circa metà dell’intensità del gruppo metilico d1 della isoleucina.

La proteina è prodotta mediante espressione in batteri cresciuti in terreno minimo in D₂O usando ¹³C-²H-glucosio e ¹⁵NH₄Cl come fonti principali di carbonio ed azoto. Un’ora prima dell’induzione vengono aggiunti α-chetobutirrato e α-cheto-isovalerato (marcati come di seguito riportato) al terreno di crescita per ottenere la marcatura desiderata rispettivamente dei residui di Ile , Val e Leu.

Applicazioni

Lo schema di marcatura è stato sviluppato per determinare la struttura di proteine di grandi dimensioni. In genere, delle proteine di grandi dimensioni viene effettuata la tripla marcatura e solo i gruppi NH (principalmente del backbone) saranno ¹H- marcati e visibili negli spettri NMR.

I NOE saranno così osservabili tra i gruppi NH del “backbone” e ciò comporterà una più bassa qualità delle struttura. Tugarinov e Kay svilupparono lo schema di marcatura IVL, basandosi sul fatto che i gruppi metilici (a) danno segnali forti grazie al “signal averaging”, che (b) sono generalmente presenti nel “core” della proteina; pertanto sono vicini tra loro e sono capaci di dare segnali NOE più forti. Inoltre, tali segnali danno importanti restrizioni strutturali che risultano altamente complementari alle restrizioni NH-NH.

Referenza:
V. Tugarinov and L.E. Kay (2003) J. Am. Chem. Soc. 125 13868-1387. (Link to Article)

Marcatura isotopica SAIL – Stereo-Array

Preparazione della proteina

La proteina con marcatura SAIL è preparata usando il metodo “cell-free” (cell-free methods)

Gli amminoacidi usati per la produzione della proteina sono preparati usando sintesi enzimatiche. La loro marcatura è guidata dai seguenti principi:

– in ogni gruppo metilenico, uno degli atomi ¹H è streo-selettivamente rimpiazzato da un atomo 2H;

– in ogni gruppo metilico, due degli atomi ¹H sono rimpiazzati da atomi²H

– i gruppi metilici prochirali di Leu e Val sono stereoselettivamente marcati ¹²C²H₃ e ¹³C¹H²H₂

– i sei membri dell’anello aromatico hanno alternativamente metà ¹²C²H e metà ¹³C¹H.

Nel sito SAIL Wiki è possibile osservare la figura illustrante lo schema di marcatura.

Applicazioni

Il pattern di marcatura SAIL è particolarmente usato per calcolare la struttura di proteine di grandi dimensioni con vantaggi particolarmente visibili negli spettri NOESY. I protoni non scambiabili delle catene laterali degli amminoacidi sono essenziali per definire la loro conformazione, ma danno spesso segnali sovrapposti. Grazie alla riduzione del numero di questi protoni, ottenibile mediante marcatura SAIL dei campioni, la sovrapposizione diminuisce e la qualità degli spettri NOESY aumenta. Inoltre, sebbene vi sia un minor numero di picchi NOE in una proteina ottenuta con marcatura SAIL rispetto a quella uniformemente marcata ¹⁵N,¹³C, è probabile che vi siano picchi NOE di più facile “interpretazione”. In alcuni casi, molti dei picchi che sono rimossi, hanno basso contenuto d’informazioni perché sono a distanza fissa (geminali) o danno informazioni già ottenibili da altri NOE. Inoltre, l’informazione ottenuta è immediatamente stereo-specifica. Un ulteriore vantaggio è che la maggiore fonte di spin diffusione viene rimossa, e pertanto si ha un aumento di accuratezza nella misura delle distanze inter-protoniche.

Altri generali vantaggi del campioni SAIL-marcati sono dovuti al riduzione della larghezza di riga dovuta alla riduzione degli accoppiamenti “long-range” ed all’eliminazione del “pathway” di rilassamento dipolare. La strategia della marcatura degli anelli aromatici rimuove accoppiamenti di legame ¹³C-¹³C, che spesso complicano l’analisi degli spettri o richiedono l’uso di metodi di analisi di dati di “time constant” per ridurre la complessità spettrale. Le misure degli accoppiamenti sono fatte più facilmente perché i gruppi CH₂ e CH₃ sono convertiti in gruppi CHD e CHD_2.

La marcatura dei gruppi metilici e metilenici nelle proteine marcate con il metodo SAIL rende anche tali gruppi disponibili per effettuare esperimenti di rilassamento, diretto al fine valutare i moti delle catene laterali.

Referenza:
M. Kainosho, T. Torizawa, Y. Iwashita, T. Terauchi, A.M. Ono and P. Güntert (2006) Nature 440 52-57. (Link to Article)

SAIL Wiki dai laboratori di Kainosho, Jee and Güntert

Marcatura con 1,3-¹³C- e 2-¹³C-Glicerolo

Preparazione della proteina

La proteina è prodotta mediante espressione in batteri cresciuti in terreno minimo con supplemento di ¹⁵NH₄Cl e o di glicerolo marcato1,3-¹³C o di glicerolo marcato 2-¹³C.

Lo schema di marcatura ottenuto è un po’ complesso. Nella figura seguente, i siti colorati in blu sono marcati nel campione marcato con glicerolo 1,3-¹³C e i siti colorati in rosso sono marcati nel campione ottenuto con glicerolo 2-¹³C.

Per gli amminoacidi sintetizzati via ciclo dell’acido citrico sono ottenibili diversi, così chiamati, isotopomeri, che poi risultano nella marcatura media mostrata sopra. Per la treonina sono mostrati gli isotopomeri individuali che portano un aumento della marcatura media. Una figura completa di tutti gli isotopomeri è ottenibile qui (here). È da notare che le popolazioni relative di isotopomeri, mostrata in queste figure, sono state determinate per la proteina SH3 (Castellani et al. 2002); per altre proteine esse possono essere leggermente diverse.

Applicazioni

Originariamente la marcatura con glicerolo 2-¹³C è stata utilizzata per le misure di rilassamento in soluzione (LeMaster e Kushlan, 1996). Gli atomi Cα, in tali campioni, non contengono atomi vicini marcati con ¹³C (con la sola eccezione della valina). Misure di rilassamento in gruppi isolati ¹³Cα-¹Hα possono, quindi, essere interpretate più facilmente, senza dover prendere in considerazione accoppiamenti degli atomi di carbonio vicinali.

Recentemente Castellani et al. (2002) ha mostrato che i campioni marcati con glicerolo 1,3-¹³C e 2-¹³C sono utili per la determinazione della struttura delle proteine a stato solido MAS NMR. I campioni hanno diversi vantaggi: (a) molti accoppiamenti-J vengono rimossi e ciò comporta picchi più stretti, (b) accoppiamenti dipolari molto forti tra atomi vicini vengono rimossi e permettono di osservare correlazioni a lungo raggio attraverso deboli accoppiamenti dipolari e (c) la sovrapposizione spettrale viene ridotta. Attualmente questa è, probabilmente, l’applicazione più comune della marcatura 1,3-¹³C e ¹³C-2-glicerolo. I caratteristici “pattern” di marcatura per ogni amminoacido possono anche essere usati per effettuare l’assegnazione (Higman et al. 2009).

Hong e Jakes (1999) sostituirono la marcatura con 2-¹³C-glicerolo con la marcatura di aminoacidi specifici (amino acid specific labelling) al fine di marcare solo la metà del amminoacidi con 2-¹³C-glicerolo.

Referenze:
D.M. LeMaster and D.M. Kushlan (1996) J. Am. Chem. Soc. 118 9255-9264. (Link to Article)
M. Hong and K. Jakes (1999) J. Biomol. NMR 14 71-74. (Link to Article)
F. Castellani, B.-J. van Rossum, A. Diehl, M. Schubert, K. Rehbein and H. Oschkinat (2002) Nature 420 98-102. (Link to Article)
V. A. Higman, J. Flinders, M. Hiller, S. Jehle, S. Markovic, S. Fiedler, B.-J. van Rossum and H. Oschkinat (2009) J. Biomol. NMR 44 245-260. (Link to Article)

Marcatura con Amminoacidi Specifici

Preparazione della proteina

La proteina è prodotta da espressione in batteri che vengono cresciuti in terreno minimo arricchito con piccole quantità di ¹⁵NH₄Cl e glucosio marcato con ¹³C, e con amminoacidi marcati e non. L’idea alla base di tale marcatura è quella che solo gli aminoacidi che si aggiungono in forma marcata saranno marcati nella proteina. Sfortunatamente, questo non sempre porta ad ottenere la marcatura che si desidera, a causa del metabolismo di E. Coli, ed il catabolismo provoca un certo grado di interconversione tra amminoacidi. Pertanto, non è possibile creare un campione proteico con qualsiasi combinazione di amminoacidi marcati. La situazione può essere leggermente migliorata utilizzando ceppi batterici autotrofi od utilizzando inibitori degli enzimi. Pertanto, se si vuole ottenere un controllo completo dell’incorporazione degli amminoacidi, devono essere utilizzati i metodi “cell-free” (cell-free methods).

Un modo più economico della marcatura solo di alcuni amminoacidi, spesso chiamata marcatura inversa, comporta l’espressione da batteri che sono coltivati in terreno minimo arricchito con ¹⁵NH₄Cl e glucosio marcato con¹³C, nonché amminoacidi privi di marcatura. Questo elimina la marcatura di questi amminoacidi e solo quelli che non sono stati aggiunti senza marcatura saranno sintetizzati dai batteri, utilizzando come fonte di carbonio il glucosio- ¹³C. Anche in questo caso, può accadere che avvenga una certa quantità di “scrambling”.

Applicazioni

La marcatura di specifici amminoacidi di solito è usata per ridurre la sovrapposizione spettrale e permettere di monitorare alcuni amminoacidi senza interferenze dovute ad altri segnali. In alcuni casi può anche essere usata per semplificare il processo di assegnazione.

Referenza:
L.P. McIntosh and F.W. Dahlquist (1990) Quart. Rev. Biophys. 23 1-38. (Link to Article)

Sistema Cell-free

Preparazione della proteina

Piuttosto che esprimere la proteina in una cellula, la proteina è espressa in vitro. Il DNA o l’mRNA della proteina sono immessi in un estratto cellulare contenente tutto il complesso per la trascrizione e la traduzione ed una varietà di altri composti, tra cui 20 aminoacidi, nucleosidi trifosfati (NTP), diversi enzimi, tamponi, sali ecc. La miscela di reazione è in genere di pochi ml-ml, ma i rendimenti che si possono ottenere sono di vari mg di proteina per ml di miscela di reazione. Chaperoni, detergenti e altri composti che facilitano il “folding” proteico possono anche essere aggiunti.

Tale marcatura è molto conveniente e semplice per poter marcare singoli aminoacidi; basterà, infatti, semplicemente aggiungerli alla miscela di reazione in forma di amminoacidi marcati ed aggiungere gli altri aminoacidi senza marcatura. Anche se gli amminoacidi marcati sono piuttosto costosi, i piccoli volumi delle miscele di reazione usati per l’espressione proteica nel sistema “cell-free” consentono di non raggiungere costi troppo elevati.

Applicazioni

L’espressione proteica in sistemi “cell-free” ha diversi vantaggi, sia per la creazione di specifici programmi di marcatura isotopica, ma anche, in generale, per l’efficienza dell’espressione. La marcatura di uno specifico amminoacido è possibile senza “scrambling” dovuto al catabolismo in E. Coli ed all’anabolismo. Inoltre, è possibile introdurre nelle proteine amminoacidi alternativi, ad esempio fluoro-triptofano, con efficienza molto maggiore rispetto a quando si utilizzano sistemi di espressione in cellule. Più in generale, l’espressione proteica in sistemi “cell-free” può essere molto utile per le proteine che non si esprimono bene nelle cellule, ad esempio perché sono tossiche per la cellula. Espressione senza cellula si sta rivelando di successo per le proteine di membrana, la cui espressione in grandi quantità, è noto, può essere molto difficile da ottenere nelle cellule.

Referenze:

G. Zubay (1973) Ann. Rev. Genet. 7 267-287. (Link to Article)

T. Kigawa, Y. Muto and S. Yokoyama (1995) J. Biomol. NMR 6 129-134. (Link to Article)
D. Schwarz, V. Dötsch and F. Bernhard (2008) Proteomics 8 3933-3946. (Link to Article)

Marcatura di Segmenti

Preparazione della proteina

Le proteine con marcatura segmentale sono marcate solo lungo una regione della catena di amminoacidi (in genere le zone N-o C-terminali). La preparazione del campione si suddivide in tre grandi fasi. La Native Chemical Ligation (NTL) prevede la preparazione di una sezione marcata e una non marcata della catena polipeptidica, utilizzando un peptide di sintesi in fase solida (SPPS). Queste due sezioni sono poi unite mediante legame chimico. Questo metodo è limitato a polipeptidi relativamente corti che possono essere sintetizzati chimicamente con SPPS.
Al contrario il caso della Expressed Protein Ligation (EPL) comporta l’espressione ricombinante di una o di entrambe le metà della proteina seguita da legame chimico dei due frammenti. Dal momento che il legame chimico non potrebbe essere utilizzato per le catene polipeptidiche non protette, il frammento N-terminale viene espresso fuso al C-terminale di un’inteina. L’attacco di un tiolo comporterà che l’inteina verrà scissa e il frammento N-terminale formerà un legame α-tioestere. Il frammento C-terminale nel frattempo verrà preparato con una cisteina N-terminale. Questo può attaccare l’α-tioestere e si potrà così formare un legame peptidico tra le due metà della proteina. Così il punto in cui si uniscono i due segmenti proteici conterrà una cisteina; questo può essere aggiunto alla sequenza della proteina, se non c’è una cistina nativa che può essere usata come punto di divisione.

Nel Protein trans-Splicing (PTS), la fase di legame è ottenuta da uno spiazzamento dell’inteina funzionalmente ricostituita. Un’inteina può essere covalentemente legata tra i due segmenti polipeptidici, ed escindere se stessa. Per “trans-splicing” della proteina, le parti N-terminali della proteina e dell’inteina sono codificate come un’ unica catena polipetidica in un plasmide ed espresse. I segmenti C-terminali della proteina e dell’inteina sono, parallelamente, codificati in un secondo plasmide e vengono espressi separatamente, utilizzando una diversa marcatura isotopica. Quando le due catene proteiche-intein vengono miscelate nelle giuste condizioni, l’inteina può piegarsi nella sua forma funzionalmente corretta e può legare covalentemente i due segmenti di proteina “target”.

Come con EPL un residuo di Cys deve essere presente l’unione di due segmenti; perché la reazione di “trans-splicing”avvenga in modo efficiente, i residui che fiancheggiano la Cys devono essere accuratamente scelti in base all’Inteina che viene utilizzata. Se questo richiede mutazioni o inserimenti nella proteina nativa, è consigliabile, verificare che questi non influenzino significativamente sia la struttura che la funzione della proteina.

Otomo et al. (1998) si sono spinti fino al punto di usare due Inteine suddivise in modo da creare una proteina in cui è stato marcato solo il segmento centrale della proteina.

Applicazioni
La marcatura isotopica segmentale non è del tutto chiara e quindi non particolarmente comune. Tuttavia, è molto utile per lo studio delle proteine con più domini in cui la sovrapposizione dei segnali può essere ridotta con la marcatura isotopica di uno solo dei domini. In alternativa, può essere utilizzata per ridurre la sovrapposizione del segnale nello studio di una proteina di grandi dimensioni, mediante marcatura di una sola parte della proteina alla volta. Un’ ulteriore applicazione riguarda la marcatura solo di un piccolo segmento di una proteina che è d’interesse funzionale e che può poi essere studiata senza altri segnali che complichino l’analisi degli spettri.

Referenze:
T. Yamazaki, T. Otomo, N. Oda, Y. Kyogoku, K. Uegaki, N. Ito, Y. Ishino and H. Nakamura (1998) J. Am. Chem. Soc. 120 5591-5592. (Link to Article)

T. Otomo, N. Ito, Y. Kyogoku and T. Yamazaki (1999) Biochemistry 38 16040-16044. (Link to Article)
V. Muralidharan and T.W. Muir (2006) Nature Methods 3 429-438. (Link to Article)

ALTRE MARCATURE

Sono qui riportati alcuni altri schemi di marcatura noti – ma questo non è comunque un elenco completo. Si prega di guardare i riferimenti per ulteriori dettagli.

Marcatura dei metili dell’Alanina

Un’estensione / alternativa al metodo di marcatura IVL e la marcatura in cui i residui di alanina sono marcati con ¹³C alla posizione Cβ e deuterati nella posizione Hα.

Referenza:
R.L. Isaacson, P.J. Simpson, M. Liu, E. Cota, X. Zhang, P. Freemont and S. Matthews (2007) J. Am. Chem. Soc 129 15428-15429. (Link to Article)

Marcatura con 10% di Glucose

Questo si traduce in un sistema di marcatura piuttosto complicato un po ‘come la marcatura con glicerolo. Può essere utilizzato per rendere possibile l’assegnazione stereospecifica dei gruppi metilici della Val e della Leu e semplifica anche esperimenti di correlazione ¹³C-¹³C MAS-NMR.

Referenze:
H. Senn, B. Werner, B.A. Messerle, C. Weber, R. Traber and K. Wüthrich (1989) FEBS Letters 249 113-118. (Link to Article)

D. Neri, T. Szyperski, G. Otting, H. Senn and K. Wüthrich (1989) Biochemistry 28 7510-7516. (Link to Article)

M. Schubert, T. Manolikas, M. Rogowski and B.H. Meier (2006) J. Biomol. NMR 35 167-173. (Link to Article)

1-Glucose Labelling

Questo schema introduce atomi¹³C isolatiin catene laterali aromatiche. Questo è stato utilizzato per studiare la dinamica di catene laterali aromatiche con metodi di rilassamento.

Referenza:
K. Teilum, U. Brath, P. Lundström and Mikael Akke (2006) J. Am. Chem. Soc 128 2516-2507. (Link to Article)

Marcatura con Acid Succinico

Acido succinici marcati [1,2,3,4-¹³C], [1,4-¹³C] o [2,3-¹³C] sono stati utilizzati come fonti di carbonio nel terreno di crescita per i batteri per marcare un complesso di raccolta della luce nei batteri fotosintetici di R. acidophila. Gli spettri di NMR MAS ottenuti mostrano un aumento della risoluzione spettrale ed una ridotta sovrapposizione di picchi.

Referenza:
A.J. van Gammeren, F.B. Hulsvergen, J.G. Hollander and H.J.M. de Groot (2004) J. Biomol. NMR 30 267-274. (Link to Article)

Marcatura con Acetato

La proteina è prodotta usando una miscela al 15% di ¹³C1-acetato, al 15% di ¹³C2-acetato ed al 70% di ¹²C1, ¹²C2-acetato. Questo riduce (ma non elimina) il numero di atomi legati direttamente al¹³C e semplifica gli studi di rilassamento.

Referenza:
A.J. Wand, R.J. Bieber, J.L. Urbauer, R.P. McEvoy and Z. Gan (1995) J. Mag. Res 108 173-175. (Link to Article)